恒遠：膜蛋白研究的整體解決方案

提起膜蛋白，浮現在廣大從事蛋白研究的科研工作者腦海中的是兩點：1.膜蛋白功能的重要性。2.膜蛋白研究的困難性。

*，膜蛋白在細胞間接觸、表面識別、信號轉導、酶活性和運輸方面都扮演著重要的角色。由于它們功能多樣，也就成為理想的藥物靶點。然而，膜蛋白的生化和結構研究一直都很緩慢。Protein Database的統計數據表明，在成功解析出三維結構的蛋白中，膜蛋白只占1%，這與膜蛋白占總蛋白的1/3的總量的差別巨大。由此也可以看出膜蛋白研究確實困難重重。

 

圖 1. 利用QIAgenes優化序列，昆蟲細胞體外進行膜蛋白表達。 利用 EasyXpress Insect Kit II，crude lysates （T）， supernatant （S）， and pellet fraction （P） by SDS-PAGE and western blotting using Penta·His antibodies. Note that microsomes with integrated membrane proteins are visualized in the pellet fraction （P） after centrifugation of the reaction.

由于膜蛋白的過表達可能對細胞有毒性，并且在純化時很難選擇合適的溶解試劑，再加上目前對膜蛋白晶體培養缺少有效方法和模型，所以要想順利地獲得膜蛋白的三維數據更是難上加難。幸虧技術總在進步，創新的產品也不斷涌現。QIAGEN在2009年推出了膜蛋白的整體解決方案：QIAgenes Expression Kit-解決膜蛋白表達難題；Ni-NTA membrane Kit-率純化重組膜蛋白；NeXtal Cubic Phase Kit-輕松獲得膜蛋白晶體不再是夢想。

QIAgenes Expression Kit預制蛋白表達載體，可以幫你克服蛋白（包括膜蛋白）表達的難題。該預制表達載體采用的GeneOptimizer軟件，對DNA序列進行以下方面的優化：稀有密碼子，GC含量，ARG位點，可變剪切點，mRNA二級結構等因素進行優化，確保優化后的序列能在E.coli的體內，體外，真核細胞的體內或體外，以及哺乳動物細胞中進行表達。

成功表達了膜蛋白，接下來的挑戰就是怎么分離出表達的膜蛋白。與可溶性蛋白不同，膜蛋白具有單重或多重跨膜結構容易發生聚集，導致膜蛋白很難溶解。目前常用的方法就是去污劑進行膜蛋白的溶解。去污劑同時具有疏水和親水區域，和膜蛋白可以形成膜蛋白-去污劑的復合物，從而可以進行進一步的純化。但是這里必須要指出的是，由于膜蛋白的種類不同，適合其溶解的去污劑類型也不一樣，這就需要在溶解膜蛋白是篩選一系列的去污劑以獲得*的溶解效果。為了從事膜蛋白研究工作者的寶貴時間，QIAGEN推出了Ni-NTA Membrane Protein Kit，專門用于帶有His標簽的重組膜蛋白的溶解和后續純化。

Ni-NTA Membrane Protein Kit有兩部分組成，一部分是膜蛋白的溶解試劑，該部分包括7種zui常用的去污劑，用于供客戶篩選自己的去污劑；另一部分是Ni-NTA純化試劑，用于在膜蛋白溶解用，利用His標簽和Ni-NTA的親和特性進行進一步純化。該試劑盒zui大的優勢在于幫助膜蛋白研究者在zui短的時間篩選得到*的去污劑，并且進行Ni-NTA純化獲得純度高的膜蛋白。


圖 2. 利用QIAGEN Ni-NTA membrane Kit篩選NhaA 的去污劑類型。
實驗結果表明，OG和NG不適合該膜蛋白的溶解，可以選擇DM， LDA0， DDM Cy6， 和FOS 進行NhaA溶解. M： His-tagged marker proteins。


圖 3.  選擇DDM進行NhaA的溶解，然后利用Ni-NTA進行純化。
TP: total protein; SF: soluble fraction; FT: flow-through fraction; W: wash fraction; E: eluate; M: markers.

在成功的純化得到膜蛋白后，如果想獲得膜蛋白的三維結構，又要面臨一個難題。據Protein DataBase 的統計數據表明，在成功解析出結構的蛋白中，膜蛋白只占了1%左右的比重。由此也可以看出，膜蛋白缺乏缺乏有效的結晶方法。目前常用脂立方相法建立膜蛋白的結晶實驗。但是該方法存在以下局限性：1.步驟超多，建立實驗過程非常復雜2.容易造成結晶孔間的交叉污染3.不適合高通量實驗4.浪費膜蛋白。為了使膜蛋白的結晶成功率提高，QIAGEN開發出了NeXtal® CubicPhase Kit。

 

 

NeXtal® CubicPhase Kit之所以能夠提高膜蛋白結晶的成功率，主要原因：1.采用NeXtal CubicPhase μplate，這種結晶板修飾了monoolein （MO，用于建立脂立方相），另外這種結晶板具有非常好的光學特性，在可見光下就可以觀測到膜蛋白晶體。2.采用專門的膜蛋白結晶溶液，QIAGEN專門開發出CubicPhase I＆II Suite用于膜蛋白結晶。 NeXtal® CubicPhase Kit非常適合高通量膜蛋白結晶。


圖4. NeXtal CubicPhase μplate結晶板，結晶孔修飾DMO。
 

圖5.利用eXtal CubicPhase Cystallization System成功進行了bacterio-rhodopsin （BR） 結晶。